摘要：目的优化川木香主要药效成分木香烃内酯（Cos）与去氢木香内酯（DL）共包封的聚乙二醇（PEG）化长循环脂质体的制备工艺，并对其进行表征。方法采用薄膜水化法制备Cos与DL共包封的PEG化长循环脂质体，以包封率为指标，通过单因素考察结合Box-Behnken响应面法对处方进行优化，并对脂质体的形态、粒径及表面电位、包封率、稳定性和体外释放度进行测定。结果最佳制备工艺为药脂比0.14∶1、胆固醇与磷脂比0.05∶1、mPEG--DSPE添加量6%、水化时间30min、探头超声时间4min。所得脂质体外观圆整、分散均匀，平均粒径为（.80±2.48）nm，多分散指数（PDI）为0.±0.，Zeta电位（?9.70±0.23）mV，Cos包封率（91.9±2.6）%，DL的包封率（94.41±1.23）%。结论工艺和处方优化后制得外观形态良好、配伍药物包封率均较高的PEG化脂质体。
川产道地药材川木香具有行气止痛之效，主治脘腹胀痛、肠鸣腹泻等症[1]，其主要活性成分木香烃内酯（costunolide，Cos）和去氢木香内酯（dehydrocostuslactone，DL）是2种药理活性广泛的天然倍半萜内酯。现代药理学对其抗炎、抗癌机制进行了大量研究，不仅拓宽了其在传统用药中用于治疗胃肠道疾病的认识[2-5]，还进一步开发了在其他疾病中应用潜力，如抗乳腺癌[6]等。然而这2种川木香内酯水溶性极差、胃肠稳定性不佳、入血量甚微且生物利用度低[3,7-8]，大大影响了其在制剂中的应用。
脂质体是将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体制剂[9]，包封药物后可改善药物水溶性和稳定性，增强渗透性和被动靶向性，从而增加药物的疗效、减少药物的治疗剂量并降低药物毒性[10-16]。然而脂质体进入循环系统后，因血中的蛋白质、酶等的作用，易发生破裂，包封的药物快速渗漏，同时脂质体易被网状内皮组织系统（RES）识别吸收[17]，被包裹的药物迅速释放，或未到达靶向目标，从而降低了应用价值。因此研究者常通过恰当修饰赋予脂质体更多功能性。脂质体经亲水性基团，如聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）或其类脂衍生物等修饰后得到的长循环脂质体，其可阻碍单核吞噬细胞系统（mononuclearphagocytesystem，MPS），并减少与血浆中调理成分的结合，从而增加其在血液中的稳定性，延长药物在血液循环中的滞留时间[18]。本实验研究了共包封2种川木香内酯配伍的PEG化脂质体（PEG-Cos/DL-Lips），采用单因素实验、Box-Behnken响应面法优化，得到最优制备工艺，并对脂质体特性和体外释放度进行表征。
1仪器与材料
1.1仪器
DD5台式大容量低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；UVCRT紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；YMNL-IIYJ超声波细胞破碎仪，南京以马内利仪器设备有限公司；JEM-Plus透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社（JEOL）；马尔文ZetasizerNanoZS90纳米粒度电位仪，杭州纽蓝科技有限公司；超凡型小容量恒温培养摇床，上海世平实验设备有限公司。
1.2试剂
Cos（批号M--）、DL（批号Q--），质量分数均≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS），0.01mol/L，pH7.2～7.4，北京雷根生物技术有限公司；三氯甲烷、无水乙醇，分析纯，四川绿森林化工有限公司；胆固醇、大豆卵磷脂、十二烷基硫酸钠、聚山梨酯80（Tween80，T80），成都市科隆化学品有限公司；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（mPEG-DSPE），迈瑞达技术公司；磷钨酸，上海源叶生物科技有限公司；葡聚糖凝胶G-50，台州市路桥四甲生化塑料厂出品；甲醇，色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Triton-x，上海西唐生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1PEG-Cos/DL-Lips的制备
采用薄膜水化法制备PEG-Cos/DL-Lips。按处方量精密称取Cos、DL、胆固醇、大豆卵磷脂、mPEG-DSPE，加入氯仿10mL，振动摇匀使其充分溶解，用恒温减压旋转蒸发仪将氯仿挥发完全使其成膜，再加入PBS5mL，用旋转蒸发仪旋转30min，使形成的薄膜水化完全，探头超声后即得PEG-Cos/DL-Lips。
Cos/DL-Lips采用同法制备，制备时不添加mPEG-DSPE。
2.2Cos和DL含量测定方法建立
2.2.1色谱条件依据《中国药典》年版川木香含量测定项下Cos和DL的检测条件设定。色谱柱为UranusC18柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-水（65∶35）；体积流量1.0mL/min；柱温30℃；进样量10μL；检测波长nm。
2.2.2对照品溶液制备取Cos、DL对照品适量，精密称定，共同置于5mL量瓶中，加甲醇稀释至Cos质量浓度梯度为.0、.0、65.0、32.3、16.2、6.5μg/mL，DL质量浓度梯度为.0、55.0、22.0、11.0、5.5、2.2μg/mL的Cos、DL对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得对照品溶液。
2.2.3线性关系考察精密吸取“2.2.2”项下系列质量浓度对照品溶液10μL，按照“2.2.1”项下色谱条件，测得峰面积（A）值，以A值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程CosY＝X＋.5，r2＝1.；DLY＝X＋，r2＝0.，结果表明Cos在6.5～.0μg/mL，DL在2.2～.0μg/mL线性关系良好。
2.2.4系统适应性考察将载药脂质体加甲醇破膜，制为载药脂质体供试品溶液，精密吸取对照品溶液、载药脂质体供试品溶液10μL，按照“2.2.1”项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。结果表明载药脂质体系统适用性良好，对测定结果无干扰。
2.2.5精密度考察取适量对照品溶液稀释至Cos与DL为高（70.0、23.3μg/mL）、中（50.0、16.6μg/mL）、低（30.0、10.0μg/mL）3个质量浓度后，精密吸取10μL，分别连续进样3次，结果高、中、低3个质量浓度下Cos峰面积的RSD分别0.84%、0.73%、0.77%，DL峰面积的RSD分别为0.54%、1.54%、1.98%，精密度较好。
2.2.6稳定性试验取载药脂质体，加入5倍量脂甲醇破膜，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液分别于0、1、2、4、8、12h按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果Cos峰面积的RSD为0.78%，DL峰面积的RSD为1.22%，结果表明供试品溶液在12h内稳定性较好。
2.2.7重复性试验取载药脂质体6份，加入10倍量脂甲醇破膜，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果Cos质量浓度的RSD为0.41%，DL质量浓度的RSD为1.03%，重复性较好。
2.2.8加样回收率试验取适量对照品溶液稀释至Cos与DL为高（70.0、23.3μg/mL）、中（50.0、16.6μg/mL）、低（30.0、10.0μg/mL）3个质量浓度后，各取1mL，每份分别加入空白脂质体溶液μL，涡旋混匀，加入5倍量甲醇破坏，涡旋混匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，按照“2.2.1”项下色谱条件进行定量测定，结果在高、中、低3个质量浓度下，Cos的加样回收率平均值分别为96.92%、96.07%、96.00%，RSD分别为1.21%、0.56%、1.31%，DL的加样回收率平均值分别为96.82%、96.59%、97.06%，RSD分别为0.77%、0.77%、0.44%，表明脂质体膜材对Cos和DL含量测定无明显影响。
2.3微柱离心法测定包封率
2.3.1葡聚糖凝胶柱的制备将葡聚糖凝胶用蒸馏水充分溶胀后，注入到2mL的注射剂里（注射剂底部填有2层滤纸以防葡聚糖凝胶泄漏），将装有葡聚糖凝胶的注射器装入塑料试管中，组成微柱离心组件。将制好的离心组件转移至离心机中，于r/min离心3min，使凝胶柱失水紧缩，备用。
2.3.2包封率测定取μLPEG-Cos/DL-Lips溶液加至微柱的顶端，于r/min离心3min，加入μL纯水洗脱3次，收集合并洗脱液，加入μL5%Triton-x进行破乳；另取μL未过柱样品，加入μL5%Triton-x进行破乳，HPLC进样检测，计算包封率。
包封率＝1－C游离/C总
C游离为游离Cos/DL含量，C总为脂质体溶液总Cos/DL含量
2.4PEG-Cos/DL-Lips处方的单因素实验优化
对薄膜水化法制备PEG-Cos/DL-Lips的处方进行单因素实验，考察药脂比、胆固醇磷脂比、mPEG-DSPE加入量、水化时间、探头超声时间共5个因素对脂质体包封率的影响。将制得样品加入流动相甲醇破坏脂质体结构释放药物，HPLC进样分析，计算包封率，结果见表1。根据结果分析，在药脂比为0.3∶1、胆固醇磷脂比为0.15∶1、mPEG-DSPE加入量为2%、水化时间为30min、探头超声时间为2min时，所得的包封率最好。结果表明，随着含药量的增加，包封率提升；胆固醇磷脂比为0.25∶1时，包封率达到最高值，但随着胆固醇加入量的增多，包封率降低，推测虽然胆固醇加入可增加膜刚性和稳定性，但超过一定范围后会与脂溶性药物竞争，导致包封率下降；mPEG-DSPE加入量在2%、4%、6%时，包封率缓慢升高，但加入量为8%时，包封率明显下降；水化时间和探头超声时间增加对包封率影响较小。
2.5PEG-Cos/DL-Lips处方的Box-Behnken响应面法试验优化
2.5.1Box-Behnken响应面法试验在单因素实验基础上，以药物与磷脂比例（药脂比，A）、胆固醇与磷脂比例（胆脂比，B）、mPEG-DSPE添加
量（C）为自变量，Cos包封率（Y1）和DL包封率（Y2）为因变量，采用Design-ExpertV8.0.6.1软件进行响应面试验设计，选用Box-Behnken模型，进行3因素3水平共17个实验点（5个中心点），2次回归正交组合试验。基于Box-Behnken响应面设计试验方案进行试验，Box-Benhnken试验设计方案及结果见表2。
2.5.2模型建立与回归分析对试验结果进行响应面分析，经过2次回归拟合后，得出响应值与影响因素A、B、C之间的回归方程为Y1＝0.＋2.A＋0.B－0.C＋0.AB－0.60AC－0.BC－4.A2－6.B2＋0.C2（r2＝0.＞0.8），Y2＝0.＋0.A＋0.B＋0.068C＋1.AB－0.AC＋0.BC－1.A2－7.B2＋0.C2（r2＝0.＞0.8）。
方程的回归分析见表3、4。Cos和DL的2次回归模型F值分别为4.76（P＜0.05）、18.24（P＜0.），表明所建立的模型具有显著性；失拟项数
值分别为6.03和2.90，P值均大于0.05，说明失拟项对于误差不显著，回归方程拟合度较好。此外，由模型可以看出，B、C和A2项显著，表明胆脂比和PEG添加量对Cos的包封率具有显著影响，而A、B、C、AC、B2项显著，表明药脂比、胆脂比、mPEG-DSPE添加量、药脂比与mPEG-DSPE添加量的交互作用对DL的包封率具有显著影响。
响应曲面图直观地反映了胆脂比、药脂比、mPEG-DSPE添加量的交互作用对响应值的影响，见图2。Cos和DL趋势相似，在胆脂比不变的情况下，Cos和DL的包封率的值随着药脂比的增大而呈现出先升高后降低趋势，随mPEG-DSPE添加量的增大而呈缓慢上升的趋势；在药脂比不变的情况下，Cos和DL的包封率的值随着胆脂比的增大而呈现出下降趋势，随mPEG-DSPE添加量的增大而呈缓慢上升的趋势；在mPEG-DSPE添加量不变的条件下，Cos和DL的包封率的值随药脂比的增大而呈先升后降的趋势，随胆脂比的增大而呈上升的趋势。
2.5.3最佳处方工艺确定及其验证在Design-Expert.V8.0.6.1软件Responses项设置2个响应值（Y1、Y2），输入包封率测定结果并进行分析，由软件对Cos和DL的拟合方程进行联合求解，分析处理得到最佳处方工艺为药脂比0.14∶1、胆脂比0.05∶1、mPEG-DSPE添加量6%、水化时间30min、探头超声时间4min，Cos、DL预测包封率分别为94.11%和96.15%，按此工艺下进行验证试验（n＝3），结果Cos包封率为（91.9±2.6）%，偏差值2.34%，DL包封率为（94.41±1.23）%，偏差值为1.81%，与预测值偏差均小于±5%，表明该法预测与验证结果基本一致。
2.6PEG-Cos/DL-Lips的表征
2.6.1TEM观察PEG-Cos/DL-Lips表面微观形态将制备得的木香内酯脂质体纯化水稀释后置于铜网上，滤纸吸去多余溶液，5%磷钨酸溶液负染自然晾干，TEM下观察其形态，见图3。结果表明脂质体在TEM下呈典型单室，磷脂双分子膜结构连续、规整，形状为囊状，形状圆整，反映出所制备的脂质体质量良好。
2.6.2粒径及表面电位考察将制备所得的木香内酯脂质体用纯化水稀释到适当浓度，放入石英皿中，用Zeta粒径电位仪测定粒径及表面电位，检测平均粒径及多分散指数（PDI）。测得脂质体的平均粒径为（.80±2.48），PDI为0.±0.，Zeta电位为（?9.70±0.23）mV，表明制得脂质体粒径较小，均一性良好，见图4。
2.6.3包封率和载药量测定按照“2.3.2”项下进行操作，HPLC进样检测包封Cos与DL的总药物质量浓度与游离药物质量浓度，计算脂质体的包封率和载药量（n＝3）。
载药量＝1－W药/W总
W药为包封药物质量，W总为投料总质量
通过微柱离心法测得Cos包封率为（91.9±2.6）%，DL的包封率（94.41±1.23）%，Cos载药量（2.66±0.21）%，DL载药量（3.02±0.15）%，Cos与DL包封率与载药量情况均良好。
2.7体外释放度考察
分别向透析袋（截留相对分子质量）中加入5.0mLPEG-Cos/DL-Lips、Cos/DL-Lips溶液、Cos、DL混合液，用封口夹将两端夹紧后，放入25.0mL透析介质（1%SDS和1%T80的混合水溶液）中，于0、0.5、1、2、4、6、8、12、16、24h时，取1mL透析液（后补充1mL透析介质，维持透析液体积不变），进行HPLC检测透析液中药物含量。以透析时间为横坐标，以透析液中Cos、DL的累积峰面积为纵坐标，绘制体外释放曲线（n＝1）。结果（图5）显示，游离药物在前4h基本释放完全；Cos/DL-Lips在前8h释药速率快，释药量达到74.55%、61.40%，8h后释药速率变缓。PEG-Cos/DL-Lips在前6h释药速率快，释药量达到65.53%、50.51%，6h后释药速率变缓。结果表明常规和PEG化脂质体均具有缓释作用，6～8h时，Cos/DL-Lips释药速度较快，同时PEG-Cos/DL-Lips可平缓释放，24h总释放度低于Cos/DL-Lips，体外情况下PEG化脂质体比常规脂质体具有较强的缓释作用，这可能是由于PEG修饰增加了脂质膜结构的稳定性。
3讨论
将来自于中药川木香的主要活性成分配伍治疗是一种具有前景的方法，精而有效的同时可减少未知成分带来的非治疗作用的风险。除了提高水溶性和可持续释放行为外，纳米载体还可轻松改变药物分布，有利于提高生物利用度和降低毒性[19]。纳米粒子的这些优点部分是由于它们具有10～nm的较小粒径，具有增强的渗透性和保留（EPR）效应[20-21]。脂质体的长循环表面修饰物一般选用神经节苷脂GM1、非离子表面活性剂、聚乙二醇及其类脂衍生物等，其中PEG及其类脂衍生物因来源普遍且无免疫毒性等，是现在常用的一种脂质体表面修饰物[22]，由于PEG分子中大量的亲水基团与水结合而构成空间位阻，降低了长循环脂质体被RES的识别和吞噬的概率，延长药物在血液中循环的时间，使药物能长时间作用于组织或细胞，从而增加药物的生物利用度，提高治疗效果。本研究采用mPEG--DSPE对Cos、DL共包封脂质体进行表面修饰，以改善2种内酯的亲水性和缓释性能，提高生物利用度。
薄膜水化法和乙醇注入法是常用的脂质体制备方法，前期试验发现乙醇注入法制备PEG-Cos/DL-Lips时，可明显看见将药物注入乙醇中时有不溶物存在，相比之下，薄膜水化法所制得的长循环脂质体溶解度良好，Cos、DL分散性均一稳定。PEG-Cos/DL-Lips的制备过程受卵磷脂种类、药脂比、磷胆比、磷脂浓度mPEG--DSPE加入量、水化时间、超声波细胞破碎时间等因素的影响，结果表明药脂比、胆脂比和mPEG-DSPE添加量对包封率影响较大，结合单因素实验与Box-Behnken设计试验对制备处方进行优化的2部分研究均发现Cos与DL包封率随自变量的变化，呈现出了相似的变化趋势。对Cos和DL来说，它们同为倍半萜内酯，且具有相似的结构，这可能导致了它们在脂质体制剂中相似的包封情况。此外，推测由于2者对脂质和水相介质的亲和力有差异，Cos油水分配系数（logP＝4.05）较DL（logP＝3.40）更高，Cos对脂质具有更好的亲和力，故Cos体外释放度低于DL。体外释放曲线表明，PEG化木香内酯脂质体具有良好的体外缓释性能，但由于2种木香内酯均为疏水性极强的亲脂性药物，于释放介质中24h时缓慢释放大部分药物后难以释放完全，还需结合更长时间的释放度考察以及进一步的体内药动学研究共同阐明PEG-Cos/DL-Lips的释药行为。
参考文献（略）来源：王文俊，严晓敏，陈自强，李奇娟，谢余，胡慧玲，王战国.木香烃内酯与去氢木香内酯共包封聚乙二醇化长循环脂质体的制备及表征[J].中草药,,50(17):-预览时标签不可点
